通讯作者：GordonJ.Freeman
作者单位：HarvardMedicalSchool,USA
摘要：PDL1和其受体PD１的相互作用抑制T细胞的应答，这种交互性的封锁是几种癌症的有效治疗方案。PDL1可以在癌细胞，免疫细胞和免疫微环境中的其他细胞表面表达，同时也发现有一些细胞外的形式。目前的研究揭示了细胞外不同PDL1形式的重要性，比如在外泌体表面的形式和可溶性的游离蛋白的形式,并且已经证明表达PDL1的外泌体可以抑制抗肿瘤免疫应答。对于黑色素瘤患者，外泌体PDL1是预判PD１抗体治疗效果的早期免疫激活标志物。在这篇文章中，我们着眼于外泌体PDL１在肿瘤免疫中的作用，以及外泌体PDL1是否是一个有用的管理肿瘤的生物标志物，能让我们区分出抑制外泌体的产生可能受益的那一类患者。
伴随着PD1和PDL1靶向抗体药物的研究成功，在过去十年中掀起了癌症治疗的革命，导致FDA批准了这些抗体药物在肺癌，肾癌，膀胱癌，黑色素瘤和霍奇金淋巴瘤，以及乳腺癌的部分亚型中的应用。很多研究探索可溶性PDL1在免疫抑制中的作用，以及其作为肿瘤进展或预测肿瘤预后的生物标志物以判断患者对免疫治疗的反应。
可溶性PDL1是低速离心全血分离血清或血浆细胞后,浮在上层的游离部分中带有PDL1分子的部分,包含多种类型的细胞外PDL1。包括细胞外囊泡相关的、外泌体上的、从膜上脱落的和分泌出的PDL1蛋白，并且分析血清可溶性PDL1往往并不区分这些组分。最近的文章表明高速离心分离得到外泌体PDL1是一种重要的组分，可以直接的，系统性的抑制抗肿瘤免疫应答。在这里,我们回顾最近外泌体PDL1和不同形式的可溶性PDL1在肿瘤免疫逃避和癌症免疫疗中的作用。我们建议区分这些不同形式的可溶性PDL1，以理解它们在免疫抑制中的作用，并探索他们成为潜在生物标志物的潜能。
1.癌症中的细胞外PDL1
1.1外泌体PDL1
外泌体是PDL1的一个很好的定位位置对于调节PD1的结合以及免疫抑制，由于在外泌体上不但有PDL1的表达，还有很多像MHC等对于T细胞至关重要的分子表达。另外，外泌体PDL1比其他形式的细胞外PDL1有更强的免疫抑制性。PD1的作用机制涉及到招募酪氨酸磷酸酶SHP2到PD1的细胞质区域ITIM处，在那里T细胞受体和CD28通路的信号分子发生近端脱磷酸，终止CD28信号传递并调节免疫抑制。如果TCR和PDL1被递送到不同的位置，PD1的免疫抑制功能并不能发挥作用。表明PDL1必须接近PD1和TCR-CD28信号，以使SHP2磷酸酶集中激活位点。如果缩氨酸-MHC分子和PDL1共表达在一个外泌体上，这可以让他们接触，产生有效的免疫抑制。
外泌体也可以通过与靶细胞融合来进行细胞交流，并且把外泌体内容物卸载到靶细胞中。在此情况下，CD的DNA被发现在恶性胶质瘤分泌的外泌体中，在牙周炎患者的唾液中也发现了包含CDmRNA的外泌体。此外，外泌体可以把microRNA，酶，其他分子递送到细胞中并影响细胞活动。这里我们聚焦在外泌体表面表达的PDL1蛋白。
免疫细胞，间充质干细胞，肿瘤微环境中的其他细胞，肿瘤细胞可以产生表达PDL1的外泌体。在异体移植模型中，人类肿瘤相关的外泌体PDL1被使用特殊的抗体从老鼠免疫细胞产生的外泌体PDL1中区分出来。结果表明外泌体PDL1的表达量与肿瘤的大小呈现正相关关系。更进一步，异体移植黑色素瘤产生的外泌体PDL1的功能是肿瘤生长的免疫抑制剂，可以被相应抗体抑制.从肺癌细胞系分离的包含PDL1的外泌体可以抑制jurkat细胞在体外的IFN-r产量。血清中分离到的高表达PDL1的外泌体可以抑制肺癌患者CD8+T细胞IL-2和IFN-r的产量。外泌体PDL1的免疫抑制功能也在同源小鼠模型中表现出来。B16-F10（小鼠肿瘤）分泌的外泌体可以抑制CD8+T细胞的增殖能力和细胞*性，也能抑制肿瘤特异性OT-1细胞的体外激活。
肿瘤细胞系分离出来的外泌体静脉注射到小鼠中，增加了肿瘤的生长。减少了B16-F10肿瘤浸润CD8+T细胞的数量。同时抗PDL1抗体治疗可以消除以上作用。使用缺少PDL1表达的外泌体，证明外泌体PDL1可以在体内作为一个系统性的免疫抑制剂。KORab27a和N-SMase2抑制了外泌体的生物起源。使用MC38结肠癌和TRAMP-C2前列腺癌注射的小鼠模型，当肿瘤的Rab27a或CD被敲除后，小鼠肿瘤生长速度变缓慢。
外泌体PDL1的重要作用。小鼠皮下注射TRAMP-C2或MC38肿瘤细胞系后，尾静脉注射野生型或CDKO的TRAMP-C2或MC38肿瘤细胞系外泌体。静脉注射野生型的外泌体助长了肿瘤的生长，并减少了老鼠的生存期，而注射CDKO的外泌体则不会产生相关表型，表明了外泌体PDL1导致癌症激进。相比注射CDKO的外泌体，注射野生型外泌体，并进行淋巴引流，表现出有杀伤能力的CD8+T细胞（颗粒酶B+）减少，而枯竭的CD4+T细胞和CD8+T细胞（TIM3+）增多，明了外泌体PDL1引发免疫抑制。当再次使用野生型的肿瘤注射之前存活下来的小鼠时，发现小鼠产生了抗肿瘤免疫记忆。
外泌体PDL1在TRAMP-C2模型中的系统性抑制作用在适当的环境中可以被克服。当同时注射野生型TRAMP-C2和CDko的TRAMP-C2细胞在小鼠的两侧，导致野生型肿瘤的生长也变得缓慢。表明减少外泌体PDL1导致成功的抗肿瘤免疫应答，尽管外泌体PDL1在别处仍然产生。这些数据表明外泌体PDL1抑制肿瘤浸润的作用产生在抑制引流淋巴结中的淋巴细胞和T细胞的激活。然而如果外泌体PDL1在局部被封锁，抗肿瘤免疫依然可以发生。这些结果表明了一个问题：如何最好的提高目标外泌体PDL1增强抗肿瘤免疫记忆反应，并抵抗PD1的封锁。
与这些结果一致，胃癌外泌体阻碍T细胞活化。此外，同时表达PDL1和MHCI类分子的外泌体对于免疫抑制是必要的。在胃癌患者中，高水平的外泌体PDL1和低表达CD4+T细胞，CD8+T细胞和颗粒酶B相关。更高水平的外泌体PDL1和更差的预后相关，但以上效应均与可溶性PDL1无关。
1.2可溶性PDL1
除了膜上的PDL1，有多种多样的游离于细胞外的PDL1.患者血清中的游离PDL1可以在体外抑制T细胞的免疫功能，但是这些早期的文献没有区分细胞外PDL1中起到调停作用的具体成分。一个早期的研究表明，可溶性的PDL1可以来自于膜上PDL1的脱离，也可以来自于正常的转录翻译分泌。对于非小细胞肺癌患者的外周血分析发现，存在游离PDL1高表达的这部分患者是抗PDL1治疗耐受的群体。进一步的分析表明，这些病人可能分泌了拼接的变种PDL1，也可以结合PDL1治疗抗体，限制了抗体的有效性。另外，鼠肿瘤中设计表达这些变体，重现了对抗PDL1治疗的抑制作用。即使只有1%的肿瘤表达这种变体，这种抵抗PDL1抗体治疗的现象也会产生。
黑色素瘤可以产生多种PDL1剪切体，很多都是缺少CDmRNA的跨膜区部分，产生的是单体PDL1可溶性蛋白。一个PDL1的剪切体在很多种肿瘤类型中表达：缺乏跨膜区，但包含一个独特的羟基端与半胱氨酸残基，而可以发生二聚作用。二聚体形式的PDL1比单体形式的PDL1在体外有更好的抑制作用。
2.PDL1是一个生物标志物
2.1细胞膜表面PDL1
细胞表面的PDL1是PD1抗体治疗应答率和联合癌症免疫治疗的生物标志物。黑色素瘤，肺癌和一些泌尿生殖系统癌症的Meta分析表明，PDL1+肿瘤中有34.1%的应答率，PDL1-的肿瘤中有19.9%的应答率。在非细胞细胞肺癌患者中，PDL1表达和治疗后的临床预后结果是相关的。因此肿瘤细胞表面PDL1分级是肺癌患者的FDA批准的治疗和诊断指导生物标志物。例如，在使用派姆单抗治疗过程中，PDL1表达的不同阈值在治疗过程中被跟踪观察。PDL%被认为是派姆单抗治疗非小细胞肺癌的有效应答的生物标志物。因为肺癌有相当的PDL1+表达率，然而，在其他肿瘤中，比如肾癌，很少有像肺癌那样有超过50%的癌细胞表达PDL1。对大多数肿瘤来说，膜表面PDL1并不是一个很有效的生物标志物。这可能反应了肿瘤环境的差异，像肾癌一般原始癌比较大，异质性较强，所以可能因此稀释了PDL1的表达。在除了非小细胞肺癌的派姆单抗治疗之外，PDL1尚不是FDA认证的可靠的生物标志物。总的来说，还需要更好的标志物来指导治疗和诊断。
2.2外泌体PDL1
外泌体能够在转移巢形成中发挥重要作用，在作为免疫治疗生物标志物中也展现越来越重要的作用。有些文章报道可溶性PDL1或外泌体PDL1是免疫治疗的生物标志物。其分析了治疗前后的所有游离的PDL1（包括总游离，微泡中，外泌体中，分泌型，脱落型），发现外泌体PDL1可以响应PD1抗体治疗，在治疗早期外泌体PDL1在治疗应答组中表现显著上升，表明外泌体PDL1是适应免疫活化的标志物。但是外泌体PDL1上升的来源并灭有明确，没有具体分析是来源于肿瘤细胞，来源于免疫细胞，还是二者兼有。
PD1通路的阻碍上调了来源于PD1+CD8+T细胞的IFNr的分泌量。这些IFNr反过来诱导肿瘤免疫微环境中各细胞PDL1的表达。然而这些上升的PDL1表达不能成为与PD1结合的免疫抑制剂。在黑色素瘤中，外泌体PDL1在PD1抗体治疗早期发现出现表达上调，因此外泌体PDL1可以在治疗两周后被监控，以区别是否有效。免疫激活和耗竭以及PD1抗体的抵抗是很复杂的，就像IFNr是如何上调基因表达来调节PDL1依赖和非依赖的免疫检查点抑制治疗。通过严格分析外泌体PDL1的角色，我们可能定义出一群可以通过靶向外泌体而获益的患者。
2.3可溶性PDL1
影响可溶性PDL1成为生物标志物的主要原因是，在很多非癌的设定中，也有PDL1的表达。循环PDL1和肿瘤PDL1之间缺少相关性可能是由于PDL1在非恶性的细胞中表达或者产生可溶性PDL1.比如孕期妇女的游离PDL1的表达量是没有怀孕妇女游离PDL1的6倍。游离的PDL1和外泌体PDL1都被报道可以从肿瘤和骨髓来源的免疫细胞中产生。虽然，外泌体PDL1在传染病中的研究不是很多，但是可溶性PDL1在炎症中表达上升。在汉坦病*感染者，HIV病*血症，寄生虫病患者的激活的DC细胞产生的可溶性PDL1的表达量也大幅上升。在严重的胰腺炎中可溶性PDL1的含量也出现明显的上升，并且与严重的传染性并发症相关。但是在这些胰腺炎中可溶性的PDL1是起到免疫抑制还是免疫激活作用的仍然不清楚。
依据目前的临床证据，在癌症患者中，可溶性的PDL1既可以作为免疫抑制的代表，也可以作为免疫激活的标志物。在睡眠呼吸暂停综合症和肺纤维化患者中，高水平的可溶性PDL1可能反应缺氧，这也和癌症相关，缺氧可以直接诱导PDL1在骨髓来源的抑制性细胞上表达。最后，可溶性PDL1作为生物标志物有一个很大的限制：可溶性PDL1在健康人中随着年龄表达量会发生上调。由于在不同的情况设定下表现出不同的可溶性PDL1水平，所以在治疗的早期应该为每位病人设置自己的PDL1水平基线，观察变化情况以指导诊疗过程的选择。
虽然这样，很多研究依然表明在固体肿瘤中，可溶性的PDL1的高表达依然与不良预后相关。少数研究报道癌症患者比健康对照中的可溶性PDL1水平更高。然而，基于目前出版的文献，可溶性PDL1是否是可用的临床标志物仍然不明确。在一例报道中，非小细胞肺癌患者可溶性PDL1表达水平上升与肿瘤表达高水平的PDL1相关（50%）。然而，在很多癌中即使体外实验显示可溶性PDL1水平与膜表面PDL1表达相关，临床上可溶性PDL1仍然无法代表细胞膜表面PDL1。这可能是因为大多数的肿瘤使用免疫组化评估PDL1时，表达量并不高，阈值大于1%即被定义为阳性。
分析这些回顾型研究比较复杂，由于它们结论不同，且有些结论的证据支持较少。例如：在相当大的肾癌患者中，可溶性PDL1与进展病理特征或更高的病理级别相关。在胃癌患者中，可溶性PDL1与更差的预后相关，但与更高的病理分级无关。相比之下，在外周T细胞淋巴瘤中，高水平的可溶性PDL1与更好的预后相关。这样的异常数据可以理解为可溶性PDL1结合了T淋巴瘤表面的PD1，抑制了淋巴瘤的生长。
其它的研究发现免疫检查点治疗后的高水平可溶性PDL1的表达与更好的预后相关，表明可溶性PDL1可以作为免疫检查点治疗后免疫激活的药效标志物。在以上所有研究中，可溶性PDL1，包括外泌体PDL1负责免疫抑制的功能尚未严格分析。基于这些有趣的报道，为了理解各种PDL1的生物学活性和功能，在患者样本中分析并严格鉴定外泌体PDL1/可溶性PDL1/脱落的PDL1是必要的。
3.临床暗示
PD1-PDL1通路抑制剂在单独使用和联用上都有越来越广泛的应用，有效的生物标会使患者极大的受益。外泌体PDL1是黑色素瘤的早期指标，以指导治疗方法的设计，达到减少*性和使临床效益最大化的目的。少数研究表明分析外周血以量化可溶性PDL1和外泌体PDL1比预先的组织活检更加有用。例如，外周血中外泌体PDL1是免疫治疗后适应性免疫的激活标志，同时也可以确定哪些患者的肿瘤更依赖外泌体PDL1而不是膜蛋白PDL1。在这些患者中抑制外泌体释放的小分子（GW/Nexinib-20分别抑制N-SMase2和Rab27a）单独使用或与免疫检查点抗体联用，可能是有效果的。而可溶性PDL1可以告诉我们如何理解在很多抵抗PDL1抗体治疗的患者中会分泌各种不同形式的PDL1以消耗PDL1抗体的机制。鉴定和分离不同类型的可溶性PDL1，判断外泌体PDL1是否在其他肿瘤中也有如此重要的功能，以及它是否是一个有效靶向免疫逃逸机制的生物标志物是PDL1作为生物标志物进入临床的先决条件，亟待深入研究。
刘桐凤
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