特发性肺纤维化病人体内的循环内皮细胞水平 [复制链接]

摘·要

背景：有实验提示循环纤维细胞和循环内皮细胞积极参与了特发性肺纤维化（IPF）病人的肺血管重塑过程。事实上，纤维化区域存在的部位拥有很少的血管，而相邻的非纤维化组织中则拥有大量的血管。循环内皮细胞（CEC）和内皮祖细胞（EPC）的数量可能反映了血管损伤和修复的平衡状态。因此，纤维细胞和内皮细胞有可能被做为IPF疾病进展和治疗成果的生物标志物。

方法：我们收集了67例经多学科诊断确诊为IPF患者的外周血样本，同时也收集了45名年龄和性别均匹配的健康志愿者外周血样本。按照标准程序分离出白细胞层（至少万个细胞），用不同的单克隆抗体标记出CEC，EPC和循环纤维细胞。细胞被CD45,CD34,CD,CD14,CD的抗体和远红外波段死/活染料标记。为了检测循环纤维细胞，外周血样本先是做了死/活细胞染色，接着标记了：CD3,CD19,CD45,CD34和CD14抗体，然后细胞被固定破膜，再标记荧光素偶联的抗胶原蛋白I单克隆抗体。

结果：IPF病人样本几乎检测不到循环纤维细胞，CEC水平很低，EPC水平在正常范围。使用尼达尼布药物治疗的病人与未治患者相比CEC水平显著升高，但内皮细胞表达CD抗原（血管内皮生长因子的II型受体）的水平变得更低。给予尼达尼布或吡非尼酮药物治疗的病人后期追踪发现其CEC和循环纤维细胞在血液样本中的百分比均较刚给药时有降低。

结论：IPF病人与健康个体相比，前者CEC水平有所降低。抗纤维化治疗药物尼达尼布和吡非尼酮进一步降低了IPF病人血液的CEC水平。这些发现可能对阐明这些药物产生作用的机制有所帮助，CEC可能做为IPF病程预测的生物标志物。

原文标题：Levelsofcirculatingendothelialcellsarelowinidiopathicpulmonaryfibrosisandarefurtherreducedbyanti-fibrotictreatments

作者：SaraDeBiasi,etal.

来源：BMCMedicine,13,1(-11-09),,13(1):.

部分翻译：面包树

校稿：土豆胖嘟嘟

背·景

特发性肺纤维化（IPF）是一种长期、进程性、不可逆且最终致死性的肺部疾病，其病因不明，病理机制尚未被阐明，目前以肌成纤维细胞聚集和肺疤痕为特征（译者按：IPF属于一种罕见病，幸运的是绝大部分新冠患者发生的肺纤维化都不属于IPF）。目前尚未有可靠的临床指标或者非入侵性的生物标志物可以预测IPF的临床进程。不过越来越多的证据表明肺泡上皮细胞的异常行为会激发间充质细胞的迁移，增殖和活化，从而导致IPF。这导致了成纤维细胞和肌成纤维细胞病灶分泌过量的细胞外基质分子，从而破坏了肺部结构。有人假设有来源于肺外的成纤维细胞/肌成纤维细胞存在，它们可能起源于骨髓，并能在血液中被检测到。

年，循环纤维细胞（circulatingfibrocytes）被鉴定出来是一种可以退出血液循环，迁移到伤口并协助伤口愈合的细胞。纤维细胞(fibrocytes)是纺锤形的，骨髓来源的间充质祖细胞，它会共表达一系列与白细胞，造血祖细胞和成纤维细胞相关的细胞表面标记。它们表达多种间充质标记，包括胶原蛋白I，以及常见的白细胞标记CD45和造血干细胞标记CD34。它们不表达T细胞标记（CD3，CD4和CD8），B细胞标记（CD19）或骨髓标记（CD14）。研究表明，在健康的捐献者中，它们在循环的有核细胞中比例最高不超过1％，并可以表达趋化因子受体，如CXCR4和CCR7；在多种生理和病理状态组织中均有发现纤维细胞。然而关于这些循环细胞详细表征的数据很少，其在血液中的相对稀有性显然是阻碍研究者们对其精确分析的一大障碍。

生物学轴CXCL12/CXCR4可能在调节纤维细胞引起肺纤维化的过程中起作用。有证据表明CXCR4+纤维细胞在肺损伤时高表达CXCL12，创建了一个趋化因子梯度，使CXCR4+纤维细胞就可以从骨髓中释放出来并被募集到肺部。一旦它们渗入并进入靶组织，纤维细胞就可以分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞。因此有假设认为循环纤维细胞可能参与了IPF病人肺血管的激烈重塑过程，或者至少能做为疾病进程的生物标志物。

多种机制在IPF发病机理中起作用，其中包括异常的血管修复和重塑。在IPF期间，纤维形成与异常的血管重塑密切相关。有大量证据表明肺泡损伤后再内皮化机制受损可能导致肺部结构的破坏，进而触发纤维化。重新内皮化失败可能会导致肺泡毛细血管完整性的丧失，在此之后肺纤维化可能再也无法逆转。纤维化区域的血管很少，而邻近的非纤维化组织是高度血管化的。在成纤维细胞病灶内几乎没有毛细血管，表明IPF病人的纤维化过程不需要新血管形成。鉴于此，循环内皮细胞（CEC）和内皮祖细胞（EPC）各自的丰度有可能反映了血管损伤/修复的平衡情况，并有可能成为疾病的生物标志物。然而目前关于IPF病人CEC或EPC的数据很少。

为了阐明CEC及其前体，以及循环纤维细胞是否在IPF病人体内发生了改变，并了解这些细胞是否能用作生物标记物，我们对一群意大利IPF患者的此类细胞做了研究，其中一些病人进行了纵向跟踪。我们采用了一种创新的方法，即利用具有声波聚焦这种复杂技术的多参数流式细胞仪来实现对这些稀有细胞类型准确而精细的分析。

实验·方法

作者募集了在意大利6个医疗中心的IPF患者，记录了他们完整的病史并进行了肺功能测试（Table1）。

随后对其中18例患者使用吡非尼酮，13例使用尼达尼布治疗，26例未给予治疗。通过静脉收集30ml血样进入EDTA采血管。静脉穿刺的前3ml血液未用于细胞分析，因为穿刺时血管壁的细胞会造成内皮细胞污染。下表展示了检测CEC和其前体细胞的染色方法（Table2）。

下表展示了检测循环纤维细胞的染色方法（Table3）。

作者使用了4激光14色配置的AttuneNxT流式细胞仪对血液细胞进行了表型分析。所有panel中均使用单染对照和荧光减一对照（FMO）设置合适的补偿和确定阳性信号。为了识别人外周血中CEC，EPC或循环纤维细胞这样的稀有细胞，必须收集庞大数量的细胞，即每个样本通过流式细胞仪收集够几百万个细胞。因此，作者使用了一种新型声波流式细胞仪，可以通过超声波将细胞在流动室中对齐，这样每秒可收集高达个细胞。要对收集超过万个细胞的流式实验做出正确的数据分析，流式细胞仪能够具备以上性能非常重要。

一款不断创新的流式细胞仪

通过声波辅助流体动力学聚焦技术，能够从高度稀释的样品采集足够多的事件。

专业抗堵塞设计，轻松处理复杂样品类型。

可以保存样品，并以12.5–1,μL/min的进样速度快速检测样本。

结果·讨论

作者在这项研究中使用的流式细胞方法与之前的研究不同，之前的流式方法主要是出于技术原因，只能分析相对较少的细胞个数（译者按：传统流式细胞术中使用流体动力学聚焦，所以不能突破低流速收集细胞的瓶颈）。利用新型声波流式细胞仪，作者可以获取和分析巨大数量的细胞，同时使用了泊松统计，作者得以正确解释数据。如图1所示，它展示一个分析CEC和EPC的典型结果，首先根据物理参数如FSC-A对FSC-H散点图排除掉细胞碎片和聚集细胞。在这个群体中，死细胞和单核细胞通过’dump’通道做了排除。图中上方中间显示的参数“时间”用于监测流式细胞仪高速获取事件的稳定性。CEC和EPC细胞根据CD34，CD45和CD的表达进行鉴定：CEC定义为CD45dim，CD34+和CD-，而EPC被定义为CD45-，CD34+和CD+。亲本群体对应的是活的（即LIVE/DEAD染色阴性）且CD14阴性的外周血单个核细胞。此外在EPC和CEC细胞中也检测了CD的表达（即II型血管内皮生长因子受体VEGFR-2，也称为KDR）。

用于识别循环纤维细胞的方法同样包括细胞聚集体的排除（通过使用FSC-A与FSC-H散点图）。在这个群体中，T淋巴细胞，B淋巴细胞和死细胞均已被排除在外。在圈选出的纯化细胞群体中，循环纤维细胞定义为CD34+，CD45+和胶原I+细胞（图2）。FMO方法也被应用于识别圈选阳性细胞。同时我们进一步尝试寻找CXCR4循环纤维细胞的存在。

在几乎所有IPF病人体内纤维细胞所占比例都小于1%。在健康志愿者对照体内纤维细胞的比例也很低（数据未展示）。此外，与健康志愿者相比，IPF病人体内的CEC水平有明显降低（图3a），与此同时，IPF病人CEC细胞表达CD的水平远远低于健康志愿者（图3b）。患者EPC细胞数量在体内的占比相对于健康对照来说有一些升高（图3c），但前者表达CD的水平依然远远低于对照（图3d）。

CD表达的下降可能是由于各种不同的原因，包括在未经治疗的患者中疾病本身的进展，以及进行吡非尼酮或尼达尼布治疗的患者中药理的作用。后者可以降低CD/VEGF-R的表达，改变VEGF–VEGFR生物学轴。例如，尼达尼布可以结合到成纤维细胞生长因子（FGF）受体、血小板衍生的生长因子（PDGF）受体和VEGFRs的胞内ATP结合位点，从而阻断这些受体自身磷酸化和下游信号转导级联通路。有另一种解释，即可以假设CEC能够融入受伤的组织参与肺的再内皮化，这种现象减少了他们在外周血液中的数量。

作者随后比较了未治疗IPF病人与给药患者外周血中内皮细胞亚群和胶原I+细胞亚群的差异。未治疗组外周血中CEC细胞占比尼达尼布或吡非尼酮给药组更低，但未治疗组CEC表达CD的水平与两个给药组相比均更高。在外周血中EPC亚群的占比，EPC表达CD的水平，循环胶原I+细胞的占比，以及纤维细胞表达CXCR4的水平，这些指标在未治疗组和2个给药组之间均没有显著性差异（图4）。

接着作者对给药组中的12名患者做了追踪随访，对比了这些患者在给药时与给药6个月后的CEC，EPC和循环纤维细胞在外周血占比的变化。患者与刚给药的自身相比，6个月后的患者外周血中CEC占比和CEC表达CD的水平均有显著降低。EPC细胞在外周血的占比以及EPC表达CD的水平在患者给药6个月前后均无明显变化。在给药6个月后，循环纤维细胞几乎已经无法被检出，循环纤维细胞表达的CXCR4水平也显著降低（图5）。

对于IPF患者进行药物治疗之前一直是个难题。有研究报道吡非尼酮通过减少体内CCL2和CCL12的产生，降低博莱霉素处理的大鼠肺中纤维细胞库的大小，在体外实验中吡非尼酮能抑制纤维细胞的迁移。这些细胞受到抑制被认为是抗纤维化药物起作用的机制，而吡非尼酮的确是第一个显示出对IPF患者有临床改善的药物。最近另一个药物尼达尼布也显示出对IPF患者症状有改善。尼达尼布最初作为癌症治疗的血管抑制因子被研发出来，并被批准用于治疗一线化疗后的肺癌合并晚期腺癌患者。尼达尼布的抑制作用最终导致成纤维细胞的增殖，迁移和存活能力均降低，并可能减少肺部的血管生成。尼达尼布在博莱霉素诱导的肺纤维化啮齿动物模型中，以及IPF患者肺部分离出的人成纤维细胞均显示出一致的抗纤维化和抗炎活性，并能抑制来自IPF患者的人肺成纤维细胞中FGF诱导，PDGF诱导，VEGF诱导的纤维化作用。与已有文献发现的现象一致，作者在8名给予尼达尼布治疗6个月后的患者外周血样本中发现CEC水平，CEC表达CD的水平以及胶原I+细胞的占比与刚给药时相比均有显著变化（图6）。尽管作者在CD表达水平指标上也发现了类似的趋势，但由于给予尼达尼布治疗的病人数量太低而不能做出任何统计分析（数据未显示）。

染色·小技巧

使用直接偶联的单克隆抗体识别胶原I蛋白，而非间接标记的抗体以避免可能发生的非特异性染色；

使用新鲜分离出的外周血细胞样本，而非冻存后再解冻，固定，通透了的外周血样本；

使用复杂的、多参数、快速、高灵敏度的流式细胞仪，以实现每个患者的新鲜血液样本短时间内都可以上样检测数百万个事件。